昆虫抗菌肽及其基因工程研究进展

【摘要】  　　昆虫抗菌肽是一类具有免疫效应的小分子多肽，它具有热稳定、抗菌谱广、无免疫原性、作用机制独特等特性，是昆虫能够抵御自然界中有害微生物侵染的重要因素。近年来，随着有关抗菌肽作用机理及功能研究的深入，其在医药领域的研究越来越引起人们的关注。本文就昆虫抗菌肽的分类、生物功能、基因工程研究进展以及在医药领域的应用等作一综述。

【关键词】  昆虫；抗菌肽；基因工程

    Abstract： Insect antimicrobial peptide is a kind of polypeptide which has the specific immunity from bacteria,fungi,virus and other pathogenic microorganisms. It has such characters as heat-durability,broad-spectrum antibiotic,no immunogen and specific mechanism,et a1. Recently,insect antimicrobial peptide has been widely used in the prevention and treatment of infectious diseases with the background and application research on it. This paper briefly reviews its classification its biological functions,the development on genetic engineering and the application in medicine.

    Key words:insect;antimicrobial peptides;genetic engineering

　  昆虫是自然界中最大的生物种群，现已确定并命名的大约有80万余种，大约占全部生物种类的55％，除海洋外，其余几乎所有的生态环境中都分布有各种各样的昆虫种群［1］。然而，国内外学者研究发现，昆虫没有Ｂ和Ｔ淋巴细胞，也无免疫球蛋白，不具备高等动物那样高度专一的获得性免疫系统。它们之所以能够在千变万化的自然界中占据极大的生存优势，是因为昆虫具有独特而有效的无细胞免疫系统，当昆虫细胞被感染后，其体内能够快速产生一种免疫诱导分子―——抗菌肽 (antimicrobial peptide)，抵抗微生物的侵染。昆虫抗菌肽是昆虫特异基因编码产生的一类有免疫效应的小分子多肽，其氨基酸残基数目小于100，是昆虫体液免疫中最重要的抗菌因子。它具有分子量小、热稳定、抗菌谱广、无免疫原性、作用机制独特、对高等动物正常细胞无害等特点。迄今已在昆虫中发现了超过200种抗菌肽类物质［2］，这些抗菌肽不仅对细菌、真菌有广谱抗菌能力，对病毒、原虫及癌细胞也有一定作用。本文对昆虫抗菌肽的分类、特性和基因工程研究进展作一综述。

    1  昆虫抗菌肽的分类

    抗菌肽是昆虫免疫体系重要的组成部分，昆虫藉此对细菌等病原菌有很强的抵抗力。尽管各类昆虫抗菌肽在大小或氨基酸组成上不尽相同，但是根据它们的序列和结构特征，可将昆虫抗菌肽分为4类：①以天蚕素(cecropin)为代表的不含半胱氨酸残基的抗菌肽。天蚕素是第一种被发现的昆虫抗菌肽，广泛存在于昆虫中，现在已经从鳞翅目的蛾类、蝴蝶及双翅目的蝇类中分离纯化出20多种天蚕素类似物。②以防御素(defensin)、死亡素(thanatin)为代表的富含半胱氨酸残基的碱性多肽。③以膜翅目昆虫中发现的蜜蜂肽(apidaecin)等为代表的富含脯氨酸残基的抗菌肽。④以双翅目昆虫中分离得到的双翅肽(diptericins)、攻击素(attacins)、麻蝇毒素Ⅱ(sarcotoxinsⅡ)等为代表的富含甘氨酸残基的抗菌肽［3］。

    2  昆虫抗菌肽的生物学功能

　　作为一种非特异性免疫分子，从昆虫免疫系统中分离出来的抗菌肽在抵御外来病原体侵染过程中起重要作用。研究表明，昆虫抗菌肽不仅对细菌有杀伤作用，对癌细胞、病毒、真菌、原虫也具有广泛的杀灭活性。

    2.1  抗细菌能力

    抗菌肽对许多致病菌（包括高度耐药性细菌菌株，如致病型大肠杆菌、硝酸盐杆菌、伤寒杆菌、金葡萄球菌等）均有抗菌作用［4］。其中富含脯氨酸和甘氨酸的抗菌肽，如果蝇肽(drosocin)、attacin、diptericin等对革兰氏阴性菌有较强杀伤作用；Defensin则对革兰氏阳性菌较为敏感；而cecropins以及2005年由Oizumi Y 等［5］从鳞翅目昆虫Spodoptera litura.中分离出来的一种新抗菌肽moricin，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都有广谱的抗菌活性。

    2.2  抗真菌能力

    20世纪90年代初，Iijima等从麻蝇幼虫血淋巴中首次分离出一种具有抗真菌活性，能抑制C.albicans生长的抗真菌肽。此后，许多具有抗真菌特性的抗菌肽也相继被分离出来，如从黑腹果蝇Drosophila Melanogaster Meigen中发现的抗菌肽drosomycin等。GenBank数据显示，已经有30多种昆虫多肽被鉴定有抗真菌活性。昆虫抗真菌肽的发现，无疑为根治真菌感染性疾病提供了新的有力手段。2001年，Andres E等［6］从鳞翅目昆虫烟蚜夜蛾Heliothis virescens体内分离得到抗真菌肽ETD151，在临床预期实验中已经证明该抗真菌肽能够有效治疗真菌感染性疾病。

    此外，有一些昆虫抗菌肽对真菌和细菌具有双重抗性，如来自果蝇的metchikowin对革兰氏阳性细菌和真菌均表现出抗菌作用，而从半翅目昆虫斑腹刺益蝽Podisus maculiventris中分离得到的thanatin则对革兰氏阳性和阴性细菌以及丝状真菌都具有很强的抗菌活性。

    2.3  抗肿瘤细胞的能力

    在肿瘤治疗时，化疗药物在抑杀癌细胞的同时，往往也会非特异性地抑杀正常细胞，产生较大的毒副作用。与此形成鲜明对比的是，昆虫抗菌肽能够直接定位并作用于肿瘤细胞的质膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，导致肿瘤细胞死亡，而对人体正常细胞则无作用［7］。2003年，邱晓燕等［8］分离出两种分子量为4 kDa和9.6 kDa的抗菌肽，它们在较低浓度下就能有效抑制人胃癌细胞MGC80－3和BGC－823、人乳腺癌细胞MCF－7以及人肺癌细胞SPC－A－1的体外增殖。作为肿瘤治疗性药物，抗菌肽无致畸变作用，无蓄积毒性，不容易产生抗药性，因此抗菌肽极有可能成为无(或低)毒副反应的抗肿瘤新药。

    2.4  抗原虫和病毒的能力

    昆虫抗菌肽对原虫和病毒（如痢疾、疟疾、Chagas氏病、莱什曼病原虫等，以及感冒病毒、乙型肝炎病毒等）也有一定作用。Sergey Chernysh等［9］从双翅目昆虫红头丽蝇Calliphora vicina 中分离出一种抗菌肽alloferon 1对流感病毒A和B的疗效显著，可望进入临床实验；Parker和Ouch等［10］报道烟蚜夜蛾幼虫的血淋巴对6种DNA、RNA病毒有明显的广谱抑制作用；更令人欣喜的是，Wachinger等［11］发现天蚕素和蜂毒素在亚毒性浓度下能够抑制艾滋病毒HIV-1的基因表达，这一发现无疑为攻克艾滋病这一顽症提供了新的希望。

    3  昆虫抗菌肽基因工程研究进展

    3.1  昆虫抗菌肽基因的分子组成

    在鳞翅目（lepidoptera）、膜翅目 (hymenoptera)以及包括果蝇在内的双翅目（diptera）昆虫中,编码抗菌肽（如天蚕素、防御素等）的基因已经被成功克隆，它们一般由20～40个氨基酸残基组成。研究发现这些基因属于典型的真核基因，具有一个CAAT框和一个TATA框，转录产物具有一个特异的帽子位点和多聚腺苷酸加尾信号序列 (AATAA)，并且具有内含子和假基因。各种抗菌多肽在翻译后首先是以前体形式存在的，其前体肽包含一个信号肽序列、肽前体序列和成熟肽［12］，前体经过蛋白水解后产生成熟肽。不同的抗菌肽都存在保守和可变序列，最近从伊蚊 (Aedesaegypti)中分离得到的一个新天蚕素cecropin，通过序列比对分析发现它与果蝇体内分离的抗菌肽的同源性为37％。而对防御素的研究发现，它们一般都存在6个保守的半胱氨酸序列［13］，从不同昆虫体内得到的防御素（成熟肽）彼此的相似性很高(均在90％左右)，其中家蝇（Musca domestica）与麻蝇(Sarcophaga peregrina) 防御素氨基酸序列的同源性高达到94％。

    3.2  昆虫抗菌肽基因的克隆及其表达

    随着分子生物学技术的发展，抗菌肽基因的克隆技术也在不断的更新，人们可以利用构建cDNA文库并进行RT-PCR扩增，或利用差异基因筛选技术选出感染与未感染的昆虫的差异表达基因，还可以依靠生物信息学的手段鉴别抗菌肽基因序列。如陈海旭等［14］利用RT－PCR技术克隆了果蝇抗菌肽diptericin的cDNA，其编码区长度为249 bp，编码83个氨基酸，蛋白分子量为9.0 kD。王来城等［15］利用PCR扩增得到家蝇防御素基因前体的cDNA片段全长430 bp，其中开放阅读框为279 bp，编码一个具92个氨基酸残基的短肽，分子量约为9.9 kD，等电点为8.44；成熟肽cDNA片段长119bp，由40个氨基酸组成，分子量为4.0 kD，等电点为8.69，甘氨酸含量为20％，并且含有防御素典型的6个半胱氨酸残基；信号肽由22个氨基酸残基(1～22)组成，在体内从N末端切掉52个氨基酸残基，形成有活性的防御素 (成熟肽)。在差异基因筛选方法上，刘振义等［16］利用差异显示反转录PCR (DDRT -PCR)技术对诱导和未诱导的家蚕总RNA进行差异显示分析，得到了一条长约241bp片段，此基因在昆虫免疫反应中可能扮演重要的角色；2005年金小宝等［17］利用DDRT-PCR技术对家蝇幼虫差异表达基因进行研究，从诱导后家蝇幼虫体内筛选出2条差异表达基因片段，长度分别为495 bp和265 bp，估计在家蝇免疫反应中起一定的作用。随着模式生物（如果蝇等）测序工作的日臻完善、生物信息学的不断发展，研究人员将能利用基因组搜索发现具有保守结构域的基因片段，进一步克隆出更多的昆虫抗菌肽新基因。

    基因重组技术是大量表达有活性抗菌肽的一条有效途径。现在抗菌肽的表达体系主要有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、杆状病毒介导的昆虫表达系统。在利用大肠杆菌表达抗菌肽时，需要考虑表达产物对工程菌的毒性以及表达产物稳定性等问题，对此，可以通过筛选抗性株系以及采用融合蛋白表达途径的策略加以解决。如Jaynes等［18］于2003年将修饰过的天蚕素B基因以融合蛋白的方式在大肠杆菌中表达，不但避开了对宿主的损伤作用，而且实现了高水平的表达。酵母表达系统是以酵母菌为宿主构建的表达系统，可有效地转录和翻译外源基因，较好地完成糖基化、磷酸化、二硫键形成等加工修饰过程，较客观地表达天然蛋白质的结构并维持其生物学活性。2005年，苏志坚等［19］用天蚕素杂合肽基因和人酸性成纤维细胞生长因子基因构建成融合基因重组质粒，然后转化到酵母中进行表达，表达产物既有抗菌肽的抑菌活性，又有细胞生长因子的促进伤口愈合的能力。在杆状病毒介导的昆虫表达系统应用中，Hellers等［20］将编码天蚕素肽原的前体片段克隆至苜蓿斜纹蛾核型多角病毒启动子的下游，目的基因成功地在重组感染的粉纹夜蛾末龄幼虫和天蚕滞育蛹中表达，且产量很高。

    3.3  昆虫抗菌肽基因工程研究中遇到的问题及解决方案    昆虫抗菌肽独特的优越性使人们更加致力于对它的研究，但是要获得足量的抗菌肽替代传统抗生素用于临床，还存在许多问题有待解决。

    3.3.1  产量较低，成本较高  人们普遍认为，只有每克抗菌肽的市场价格低于10美元，抗菌肽才有可能实现真正意义的商品化。由于抗菌肽分子量小，直接诱导、分离、提纯存在一定困难；此外，单纯依靠纯化有限的天然抗菌肽显然无法满足实际科研和临床的需要。所以，化学合成和基因工程便成为获取抗菌肽的主要手段。然而化学合成肽类物质，成本较高；通过基因工程技术，在微生物中直接表达抗菌肽基因，又有可能造成宿主微生物自杀而不能获得表达产物。因此，如何提高抗菌肽的生产效率，降低成本，提高抗菌肽的生物稳定性就成为应用昆虫抗菌肽必须解决的关键问题。

    针对上述难题，应用现代基因工程技术，如突变体技术，融合蛋白表达技术，展示技术，转基因动植物等进行的生产改进可能会成为人们获得药用抗菌肽有效的、具有潜力的途径。抗菌肽基因表达的研究最初是在原核表达系统中进行的，但由于抗菌肽对细菌的杀伤作用及原核表达缺乏酰氨化功能，因此抗菌肽基因只能以融合蛋白形式在E.coli中表达，串联体表达是增加目的肽的表达效率的有效途径，是将肽抗生素基因一个紧接一个串联起来，而后插入适宜的表达载体中进行表达。这样，一方面借助串联体的空间折叠来屏蔽肽抗生素单体可能给工程菌带来的毒性，另一方面利用串联单体间蛋白酶或化学裂解位点可将融合蛋白降解成单体而大大提高表达物产率。如Lee等［21］将蟾蜍肽抗生素buforinⅡ基因连接成串联体，结果多聚体在大肠杆菌中以包涵体形式高水平表达，而且，其抗微生物活性与天然buforinⅡ一致。这种多拷贝串联表达的模式不仅显著提高了重组肽抗生素的产率，而且为其他小分子活性肽的表达制备提供了新思路。

    3.3.2  活力有限  与传统的抗生素相比，昆虫抗菌肽的抗菌活性还不是十分理想。因此，结合抗菌肽活性与结构的相互关系有目的地改造已有的抗菌肽和设计新抗菌肽分子，是应用和创造高活力抗菌肽的有效途径。2002年，黄亚东等［22］合成的cecropin AD基因 (CAD基因) 就是由天蚕素簇抗菌肽A、D基因经定点突变改造融合而成的新基因，对细菌的杀菌效价比cecropin A或D有显著提高。以点突变技术修饰的活性位点，并在酵母或细菌中高效表达，为开发具有自主知识产权的新的抗真菌病畜禽用抗生素和人用医药生物制剂提供前期的知识产权和技术储备。

3.3.3  生物稳定性问题  由于蛋白酶的存在，在体外实验和体内治疗时保持稳定的生物活性是任何一种药物用于临床治疗的首要指标。而抗菌肽不易被胰蛋白酶、胃蛋白酶水解，在100℃加热时仍能在较长时间内保持一定的生物活性，这些特性使抗菌肽的临床应用前景更加的光明。但是若将抗菌肽用于治疗，仍须利用基因工程技术对抗菌肽基因结构加以修饰，以提高其对其它蛋白酶的耐受力，使其在生物体内保持最佳生物活性及稳定性，为抗菌肽能够适用于临床治疗创造良好的条件。2003年，黄亚东等［23］又利用抗真菌肽thanatin基因与cecropin AD基因 (CAD基因) 融合拼接为thanatin-CAD双价基因，从而成功减低各自对宿主细胞的毒性，保证了其生物稳定性，并实现了其在大肠杆菌中高表达。因此，若使抗菌肽在临床上得到广泛应用，不仅需要保证有一定的产量，通过加工修饰提高抗菌肽活力并保持其生物稳定性也是一个非常重要的因素。

    此外，要获得天然基因表达的稳定抗菌肽，用转基因动物获取有杀菌活性的转基因产物将是一条理想的途径。Yarus等［24］将小鼠乳清酸蛋白基因（WAP）调控序列与牛气管抗菌肽基因 (TAP) 构建的pWAP／bTAP 融合基因注入小鼠原核期受精卵，成功获得了pWAP／bTAP 转基因小鼠，并从乳汁中获得了目的基因产物，体外试验证实，此种转基因产物对大肠杆菌具有杀伤作用。通过转基因动物还可以提高动物抗病能力和传染病防治能力，Reed等［25］将小鼠IL-2基因与抗菌肽shivala基因和sV40多腺苷酸化／剪接信号肽连接构建的融合基因，注入小鼠原核期受精卵，结果该转基因老鼠对基因布鲁氏杆菌感染抗菌能力明显增强。这使得应用抗菌肽相关基因对某些人类难治性疾病进行基因治疗不再成为梦想。在转基因植物研究方面，Sharma等［26］将天蚕肽cecropins B基因转入水稻，利用稻谷壳质酶信号肽使cecropins B分泌到细胞间隙 ,一方面保护了目的肽免受细胞质中肽酶的降解，另一方面，获得了抗病能力增强的植株品系。随着对昆虫抗菌肽的种类、结构和作用机理的进一步探索，抗菌肽的基因工程研究将不断深入，通过基因工程技术改造抗菌肽基因结构，从而获得更加稳定的高活力抗菌肽，必将促进其在各领域的广泛应用，具有极大的应用前景。

    4  昆虫抗菌肽在医药中的应用前景

    抗生素的发现曾经为人类抗御疾病提供了有效手段。但是，随着抗生素的滥用，病原微生物也在变异和进化中不断捕获耐药能力，以致近些年不断有“超级细菌”的新闻见诸报道。作为新一代天然抗生素，抗菌肽的作用机理不同于传统抗生素，它通过电荷中和的机制穿透细菌膜性结构杀死细菌，即它作用于靶“结构”而非“功能”，因此，极大地减少了靶菌株产生抗药性的可能性；此外，尽管昆虫抗菌肽的有效活性浓度与传统的抗生素相比相对较低，但是由于它具有抗菌谱广、种类多、对许多致病菌都具有明显有效的抗菌作用，以及无致畸性、无蓄积毒性等特点，均使其作为现有抗生素可能的有效替代品而备受人类的青睐。