谈人腹膜间皮细胞的体外培养

摘要：  目的：建立简便有效的人腹膜间皮细胞（HPMC）的体外培养方法。方法：用 0.2% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTANa2 消化人大网膜组织，细胞悬液经 100 目筛网滤过后进行培养。用形态学、免疫组化（SP 法）鉴定细胞。结果：分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状。免疫组化鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性，第Ⅷ因子、白细胞 CD45 抗原阴性，证实培养的细胞的确是 HPMC。结论：胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离 HPMC 的方法。

关键词：  腹膜间皮细胞；胰蛋白酶；大网膜

腹腔粘连是腹部手术后常见的并发症，常引起肠梗阻、慢性腹痛，以及不孕、不育等，而且粘连很难通过再次手术加以改善[1]。近年来对腹腔粘连的形成机制有了较深入的研究，认为腹腔粘连的形成与多种因素有关，其中腹膜间皮细胞的完整性及功能正常与否是腹腔粘连形成的关键因素[2]。因此，建立人腹膜间皮细胞培养体系，为体外研究人腹膜间皮细胞生理功能及其在腹腔粘连防治中的作用提供了有效手段。
    早在 20 世纪 80 年代初，Wu 等[3]通过直接从患者腹水中获取腹膜间皮细胞的方法，成功地培养出人腹膜间皮细胞。此后 Kern[4]和 Stylianou[5]等分别采用胶原酶消化组织法和直接种植法，培养出人腹膜间皮细胞，Stylianou 并完整地阐述了人腹膜间皮细胞的鉴定方法。虽然目前人腹膜间皮细胞培养方法很多，但由于培养人腹膜间皮细胞的条件苛刻且易受成纤维细胞污染等原因，要获得大量、高纯度的人腹膜间皮细胞仍为实验研究中的难题。我们综合文献方法并加以改进，建立了人腹膜间皮细胞体外培养方法。
    1    材料与方法
    1.1    取材
    无菌取自江苏省中医院普外科、肛肠科腹部手术切除的大网膜。
    1.2    主要仪器设备
    眼科剪、镊，培养皿，50 mL 培养瓶，吸管，10 mL 尖底离心管，CO2 培养箱，超净台，离心机，倒置相差显微镜，100 目不锈钢筛，0.22 滤膜过滤器。
    1.3    主要试剂
    1.3.1    PBS 液    氯化钠 8.0 g，氯化钾 0.2 g，磷酸氢二钠 1.56 g，磷酸二氢钾 0.2 g 溶于 1 000 mL 三蒸水中，过滤灭菌分装，室温保存。
    1.3.2    1640 培养基    Invitrogen Corporation 公司产品，按说明配制，并使其含有青链霉素各 100 U/mL，小牛血清 20%。
    1.3.3    细胞消化液    胰蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司）2.5 g，EDTA 二钠盐 0.16 g 溶于 1 000 mL PBS 液中，过滤除菌，分装于小瓶内，-20℃保存。
    1.3.4    免疫组化抗体    波形蛋白抗体，第 8 因子抗体，CD45 抗体均为福建迈新公司产品。
    1.4    腹膜间皮细胞的原代培养
    无菌摘取腹部手术切除的大网膜，剪取血管脂肪相对少的网膜组织，大小约 3 cm×3 cm，将剪取的网膜组织置于含 500 U/mL 青霉素和 500   L/mL 链霉素的无菌生理盐水中浸泡 20 min，然后用生理盐水流动冲洗 5 min，将漂洗后的网膜组织平铺于无菌培养皿内，再用 PBS 反复漂洗至没有油珠漂浮，同时剪除血管及脂肪，将洗净的网膜组织剪成 1 cm×1 cm 大小，加入 0.2% 胰蛋白酶 - 0. 02% EDTA 细胞消化液 20 mL，用吸管反复吹打均匀，装于 50 mL 培养瓶内，放置于 37℃，体积分数为 5% CO2 培养箱内消化 25 min，每 5 min 振摇 1 次，最后 5 min 保持静止。消化结束后将消化液用 100 目不锈钢筛过滤于培养皿内，加入等量含 20% 体积分数的胎牛血清的 RPMI-1640 完全培养液终止消化。用移液器分装于 10 mL 尖底离心管，1 000 r/min，离心 10 min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，分装于 50 mL 培养瓶，放置于 37℃，5% CO2 培养箱内培养。
    1.5    腹膜间皮细胞的传代培养
    原代细胞培养 24 h 后，镜下观察细胞贴壁情况，贴壁良好的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内全部陈旧培养液，贴壁情况差的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内一半的陈旧培养液，此后每 3 d 全换液 1 次。约培养 5~8 d 细胞生长融合，可以首次传代。当细胞生长融合成单层，PBS 漂洗 2 次，每瓶加入完全消化液 2 mL，在 37℃，5% CO2 培养箱内消化 15 min。镜下观察细胞消化情况，细胞脱落变形后，加入 4 mL 完全培养液终止消化。将细胞悬液分装于离心管内 1 000 r/min，离心 10 min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，传代于 6 孔板（将盖玻片裁成 4 片，泡酸，洗净，烘干，在盛有多聚赖氨酸的塑料培养皿内浸泡 5~10 min，取出，在干燥箱内 60℃烘干 1 h，高压灭菌。将灭菌后的盖玻片放置于 6 孔板内，每孔 3 片）内，加入适量完全培养液。继续在 37℃，5% CO2，湿度 95% 的培养箱中静置培养，至细胞完全贴壁伸展。
 1.6    腹膜间皮细胞的鉴定
    1.6.1    免疫组化鉴定    ①吸去 6 孔板内培养液，PBS（pH 7.2~7.4）洗 2 次，每次 3 min，将细胞爬片取出，用生理盐水洗 2 遍，随即放入 10% 中性福尔马林固定 30 min；蒸馏水洗 4 次，每次 3 min。②加入 0.1% TritonX100（PBS pH 7.4 配制）