谈人腹膜间皮细胞的体外培养

，室温 10 min，PBS 洗 3 次。③抗原修复，根据不同一抗的要求进行（CD45 无须修复，波形蛋白和第 8 因子用柠檬酸缓冲液高压加热修复。滴加即用型一抗、室温下孵育 60 min BPS 洗 3 次每次 5 min，去除 PBS。每张盖玻片滴加 50   L  Elivision 试剂盒中的试剂 A，室温下 20 min，PBS 洗 3 次，每次 3 min。每张盖玻片滴加 50   L Elivision 试剂盒中的试剂 B，室温下 30 min，BPS 洗 4 次，每次 5 min）。④DAB 显色，每张盖玻片滴加新鲜配置的 DAB 显色溶液，在显微镜下观察 3~10 min；自来水洗 5 min，苏木素复染，0.1% 盐酸分化，自来水冲洗，PBS 返蓝。⑤脱水，逐级脱水：过 70%、80%、90%、95% 酒精各 1 次，100% 酒精 2 次，每次 1 min；透明，过二甲苯溶液 3 次，每次 3 min。⑥封片，将有细胞的一面向下，用中性树胶封片。自然通风干燥。普通光学显微镜观察，拍照。
    1.6.2    扫描电镜鉴定    ①细胞准备：同间皮细胞传代，取出细胞爬片浸入 PBS 中漂洗细胞表面；②固定：将细胞爬片放入青霉素小瓶中，加入 4℃预冷的 3% 的戊二醛，4℃过夜。吸出固定液，用 PBS 浸洗 2 次，每次 10 min。再加入 4℃预冷的 1% 的四氧化锇，在 4℃固定 1 h。PBS 浸洗 2 次，每次 10 min。③脱水：用 30%、50%、70%、80%、90%、100% 酒精逐级脱水，各 10 min。④置换：将样品放入醋酸异戊醋:丙酮 = l:1 的混合液中 10 min，然后放入醋酸异戊酯中 2 次，各 10 min；⑤临界点干燥：预冷临界点干燥室的样品室，使其温度降到 0℃，将玻片放入样品篮，样品篮的上下两面事先铺好滤纸，在保证细胞被醋酸异戊醋浸润的情况下，将样品篮放入样品室。拧紧室盖，充入液态 C O2，同时缓慢排出 CO2 气体，反复 3 次，使液态 CO2 置换出细胞中的醋酸异戊醋，加热样品室，使 CO2 达到临界状态。缓慢的排出 CO2，待样品室压力降为零，取出样品。⑥离子溅射镀膜：从样品篮中取出玻片，用银胶将干燥样品粘到样品托上。
    导电胶干燥后，将样品托放入离子溅射仪的真空罩内，抽真空。当真空度达0.1 托后，加高压 1 000 V，离子溅射镀膜。⑦电镜观察：启动扫描电镜，安装样品，观察细胞表面结构，拍照。
    1.6.3    透射电镜鉴定    ①消化间皮细胞，1 000 r/min，离心 5 min，3% 戊二醛固定，PBS 洗涤 2 次，每次 20 min；②1% 锇酸固定 30 min，PBS 浸洗 2 次，每次 10 min；③脱水：用 30%、50%、70%、80%、90%、100% 酒精逐级脱水，各 10 min；④100% 丙酮固定 10 min；Epon812 浸泡、包埋；⑤LKB-V 型超薄切片机切片（70   m）；H-600 透射电镜（日本）下观察、拍片。
    2    结    果
    刚从大网膜消化下来的间皮细胞在倒置显微镜下为葡萄串状，50% 的间皮细胞大约 24 h 左右贴壁，个别细胞伸展。72 h 所有贴壁细胞均伸展，呈多形性（梭形、椭圆形、多角形等），边缘不整，细胞呈现拉网状生长，与相邻的细胞相互连接。以后细胞拉网生长现象减少，生长融合呈多角形，大小较为一致，似铺路鹅卵石样外观。细胞经传代培养后，2~4 代细胞的形态与生长方式与原代细胞基本无异。5 代开始间皮细胞增殖明显缓慢。
    2.1    免疫组化鉴定
    光镜下观察所培养细胞的波形蛋白染色为阳性，是间皮细胞的特征。波形蛋白抗原阳性， CD45、第 8 因子抗原阴性可排除成纤维细胞、血管内皮细胞和白细胞。
    2.2    超微结构
    扫描电镜下细胞完全铺展，与周围对比不强烈。细胞呈椭圆形或多角形，胞核圆形，位于细胞中央、较小，有核处细胞隆起较厚。细胞表面大量密集的微绒毛，细胞周围高密度的绒毛在背景中形成高密度的晕圈。透射电镜检查：细胞表面存在大量多少不等的微绒毛，细胞浆内丰富的内质网和线粒体，未见 Weibel palade 小体。
    3    讨    论
    间皮细胞培养中要注意以下几点：①正确确定首次换液时间，避免换液过早，首次换液越晚越好，最好第 3 天进行，动作轻柔，减少振荡。原代培养头 3 天尽量勿动培养液，以免干扰间皮细胞贴壁，换液越早丢失的间皮细胞数目越多；②胰蛋白酶消化后，消化液中的间皮细胞不要，因为最先消化下来的往往是活力不好的细胞。终止消化后用培养液吹打下来的细胞活力好，生长快；③注入培养瓶中的间皮细胞要具备一定细胞密度，不要太稀。生长良好的细胞可提供“化学信使”去促进其它细胞生长，因此细胞密集时它们彼此能提供和接受该“化学信使”越长越好；假若过稀，则可因缺乏该化学信使而停止生长、死亡。此外，腹膜供体的年龄越年轻越好。
    虽然目前国内、外的文献已介绍了多种间皮细胞的培养方法，但这些培养方法均较为复杂且重复性不高，不能满足科学研究的需要。本实验所建立的体外人腹膜间皮细胞培养模型，操作简单，培养迅速，4~7 d 即可传代，可重复性强。
【参考文献】
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〔2〕刘洪斌, 李东华, 郭世铎. 腹腔粘连形成机制及治疗研究进展〔J〕. 中国中西医结合外科杂志, 2005, 11(1):84-86

〔3〕Wu YJ, Parker LM, Binder NE, et al. The mesothelial keratins: a new family of cytoskeletal proteins identified in cultured mesothelial cells and nonkeratinzing epithelia〔J〕. Cell, 1982, 31:693

〔4〕Kern PA, Knedler A, Eckel RH. Isolation and culture of microvascular endothelium from human adipose tissue〔J〕. Clin Invest, 1983, 71:1822

〔5〕Stylianou E, Jenner LA, Davies M, et al. Isolation,culture and characterization of human peritoneal mesothelial cells〔J〕. Kidney Int, 1990, 37:1563