在体微透析检测豚鼠胆红素脑病模型脑组织兴奋性氨基酸神经递质

作者：贲晓明　陈舜年　秦玉明　何振娟　孙安阳　吴圣楣

　　［摘　要］　目的　探讨胆红素脑病动物模型制作及其脑组织中兴奋性氨基酸(EAA)神经递质变化。方法　豚鼠腹腔内给予胆红素200 μg/g后8 h，电镜观察脑组织形态结构，在体脑内微透析提取神经突触间细胞外液，HPLC检测分析天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Gly)。结果　胆红素毒性脑组织神经元及其线粒体肿胀，细胞外Gly含量为21.35±4.87 μM，明显高于对照组14.02±1.56 μM (P<0.01)；胆红素毒性脑组织细胞外Asp，Glu与对照组比较差异不显著(P>0.05)。结论　胆红素毒性脑组织细胞外甘氨酸(Gly)含量增加，可提高NMDA受体对EAA神经递质Asp及Glu敏感性，致NMDA受体过度活化。
　　［关　键　词］　兴奋性氨基酸；胆红素脑病；脑内微透析；高效液相色谱；豚鼠
　　［分类号］　R-332　　［文献标识码］　A
　　［文章编号］　1008-8830(2000)01-0018-03

Microdialysis of Hippocampus for Measurement of the Neurotransmitter in Bilirubin Induced Encephalopathy Guinea Pigs in Vivo

BEN Xiao-Ming, CHEN Shun-Nian, QIN Yu-Ming, et al.
(Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200092)

Abstract:　Objective　 To study the excitatory amino acid (EAA) neurotransmitter concentration in bilirubin induced encephalopathy. Methods　Guinea pigs with bilirubin-induced encephalopathy were fixed in the stereotaxic frame. The microdialysis probe was inserted in the hippocampus zone, Kreb's ringer was irrigated and extracellular liquid was collected for analyses with high performance liquid chromatography (HPLC). Results　The concentration of EAA neurotransmitter Gly in the extracellular liquid of the bilirubin precipitated brain was 21.35±4.87 μM，significantly higher than that in the control group (14.02±1.56μM). EAA neurotransmitter Glu and Asp did not show any significant change in the animal model compared with the control. Conclusions　The increase of EAA neurotransmitter Gly concentration in the extracellular liquid of the bilirubin precipitated brain tissues might increase the sensitivity of the ligand Asp and Glu to the NMDA Receptor.
Key words:　Excitatory amino acid; Bilirubin encephalopathy; Microdialysis;
High performance liquid chromatography; Guinea pig

　　新生儿高胆红素血症是新生儿临床常见病症，并发胆红素脑病可致新生儿死亡，幸存者常留下神经系统后遗症，合理科学防治胆红素脑病对于优生优育有重要价值。近年来研究表明NMDA受体过度活化参与胆红素脑病发生［1］，为进一步探讨NMDA受体活性变化的内在机制，我们对胆红素神经毒性新生豚鼠进行在体脑内微透析，提取神经突触间细胞外兴奋性氨基酸(excitatory amino acids, EAA)，并作高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)检测分析。

1　材料与方法

1.1　动物模型制作
　　生后1～2 d豚鼠18只，重20～25 g，雌雄不拘，购自上海生物制品研究所。随机分成对照组和模型组，每组9只。对照组豚鼠予生理盐水0.5 ml腹腔注射，模型组豚鼠［2，3］于腹腔内给予胆红素200 μg/g。
1.2　脑组织形态结构观察
　　动物模型制作后8 h，取豚鼠脑组织投于戊二醛溶液中，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，电镜观察。
1.3　微透析提取神经递质
　　微透析探头(microdialysis probe)购自瑞典CMA公司，透析膜长3 mm、直径0.5 mm、透析截流分子量20 000 Daltons，探头长14 mm，不锈钢外管直径0.64 mm。模型制作8 h后用乙醚吸入麻醉，按Sander方法［4］将大鼠固定于立体定向仪(stereotaxic frame)中，参照鼠立体定向图谱，将探针固定于海马区域(探针位置术后经由解剖证实)。灌流液为Kreb's-ringer液，流速2.5 μl/min，灌流1.5 h后开始收集检测样本，持续收样1 h。
1.4　EAA神经递质HPLC分析
　　取微透析细胞外液50 μl、加内标液(甲硫氨基砜250 μM/L)50 μl，涡流振摇，加入micropure separator (millipore)离心去除蛋白质、核酸及悬浮大颗粒。取滤液50 μl，加入衍生化试剂(PITC异硫氰酸苯脂∶甲醇∶三乙胺∶水=1∶7∶1∶1)50 μl涡流振摇、室温反应10 min，真空干燥［4］。真空干燥样本加入NaH2PO4稀释液500 μl, 涡流混匀，取200 μl混合液进样。分析柱为HPLC-氨基酸专用分析柱，管径15 cm×4.6 mm(ID)，柱温维持38℃；柱填充Taq硅胶，规格120A；流动相A泵进样15MNaAc，B泵进样乙晴∶甲醇∶水=9∶3∶8，A+B进样流速1 ml/min。紫外检测、波长254 mm、氨基酸波峰积分微处理计算氨基酸含量［4］。

2　结果

2.1　脑组织形态结构
　　电镜观察显示:豚鼠腹腔给予胆红素后8 h，脑神经元及其线粒体肿胀，而正常对照组脑线粒体不肿胀。见图1，图2。

图1　模型组线粒体肿胀明显(×6000倍)
Fig 1. Mitochodrial swelling in brilirubin precipitated neurons.

图2　对照组正常线粒体(×6000倍)
Fig 2. Normal neuron mitochondria in the control group (×6000)

图3　透析液HPLC氨基酸色谱图
Fig 3. Excitatory amino acid chromatography

2.2　透析液HPLC氨基酸含量及色谱图
　　模型组透析液Gly含量为21.35±4.87μM，明显高于对照组14.02±1.56 μM(P<0.01)；模型组透析液Asp，Glu含量与对照组比较差异不显著(P>0.05)。见附表。色谱图见图3。