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HPLC在测定血浆同型半胱氨酸含量中的应用

[作者:5189lw[来源：知源论文网]| 打印 | 关闭 ]

摘要  目的：探讨高效液相色谱法(HPLC)在测定血浆同型半胱氨酸含量中的应用。方法：血浆同型半胱氨酸用邻苯二甲醛(OPA)衍生,经Hypersil AAODS色谱柱（2.1mm×200mm，5μm），用0.02 mol·L-1NaAc∶乙腈∶四氢呋喃=56∶43.8∶0.2的流动相洗脱,柱温40℃,检测波长330nm,流速1.3mL·min-1。结果：线性范围为0.48～31.25μg·mL-1,回归方程为A=27.167C+38.765，r=0.9962;平均回收率为98.61%,RSD=1.84(n=6)，日内及日间相对标准偏差均小于5%。结论：该法准确、简便、快捷，适用于大多数实验室。

关键词   同型半胱氨酸; 高效液相色谱法  同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是一种含硫氨基酸,是蛋氨酸循环中S腺苷基高半胱氨酸水解酶水解反应的产物。研究表明, 血中 Hcy 升高可致流产、新生儿缺陷、中风、老年性痴呆及其它老年性疾病如骨质疏松等，维生素B12及叶酸缺乏、心脑血管疾病等都可反映出血浆Hcy浓度异常变化[1]。血浆中Hcy测定已成为国外诊断维生素B12及叶酸缺乏、早期心脑血管疾病监控疗效的常规方法。

    同型半胱氨酸的测定常用放射免疫法[2]、荧光偏振免疫分析法[3]及HPLC法等[4～6]。本研究在参考有关文献的基础上，对色谱条件进行了适当的改进，使测定更加简便、快速,应用于实际样品测定,效果良好。

    1  仪器与试剂

    1.1  仪器  HP1100高效液相色谱仪（包括在线脱气机、四元泵、柱温箱、荧光检测器、化学工作站），分析天平（A/D，1/10万，日本）。

    1.2  试剂  衍生剂:50mg邻苯二甲醛(OPA)溶于4.5mL甲醇中,再加入0.25mol·L-1硼酸缓冲溶液(pH=8.4)0.5mL,巯基乙醇50μL,避光保存。1 g·L-1Hcy标准储备液:1mg Hcy溶于1mL 0.045mol·L-1HCl溶液中。Hcy标准品、邻苯二甲醛(Sigma公司)，甲醇、乙腈(色谱纯，天津科密欧化学试剂开发中心)，巯基乙醇、冰乙酸、乙酸钠、四氢呋喃均为分析纯试剂。三蒸水为本实验室自制。

    2  实验方法

    2.1  色谱条件

    色谱柱为Hypersil AAODS（2.1mm×200mm，5μm），流动相：0.02mol·L-1NaAc(pH=7.20)∶乙腈∶四氢呋喃=56∶43.8∶0.2,柱温：40℃，流速为1.3mL/min,检测波长330nm,进样量：20μL。 2.2  标准曲线的制作

    以1g·L-1Hcy标准储备液做不同倍的倍比稀释，分别取40μL于6支5mL具塞离心管中,分别加入40μL过氧化氢,室温放置30min后于70℃水浴中用氮气吹干,各加入30μL巯基乙醇和70μL衍生剂,4min后取20μL进样。回归方程为：A=27.167CA+38.765，r=0.9962,线性范围为0.48～31.25.00μg·mL-1。

    2.3  样品分析

    a：同型半胱氨酸

    图1  标准品（A）和血浆样品(B)的色谱图谱    取样品血浆0.5mL于具塞离心管中,加入0.5mL乙腈沉淀蛋白,离心后取上清液40μL于5mL具塞离心管中,分别加入40μL过氧化氢,室温放置30min后于70℃水浴中用氮气吹干,各加入30μL巯基乙醇和70μL衍生剂,4min后取20μL上机进样。色谱图见图1。表1  回收率结果 （μg·mL-1）

    样品量加入量测得量回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）11.130.101.25101.6221.130.101.19 96.7431.130.351.46 98.6541.130.351.47 99.3251.130.601.68 97.1161.130.601.70 98.2798.611.84

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