蝰蛇(缅甸亚种)毒凝血因子Ⅹ激活物FⅤe-1的分离纯化与理化活性的研究

【摘要】  【目的】 从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离纯化一种凝血活性因子Ⅹ激活物FⅤe-1,并研究其理化性质?序列测定以及凝血活性?【方法】 应用阳离子交换层析?分子凝胶过滤层析分离纯化蛇毒,采用MALDI质谱测定法测定分子质量,等电聚焦电泳测定等电点,Edman降解法测定蛋白N末端氨基酸序列,发色底物法和SDS-PAGE等方法测定FⅤe-1的酶学特征和凝血活性? 【结果】 从蝰蛇(缅甸亚种)毒分离得到的FⅤe-1为单体蛋白,相对分子质量为13 808,等电点4.6, 0.5 mg FⅤe-1的凝血活性与1.5625 u的凝血酶或与54.93 ng RVVⅩ的凝血活性相当;可激活FⅩ,但对凝血酶和纤维蛋白原无作用;酶活性的适宜pH为 6.5 ~ 7.5,适宜温度为25 ~ 60 ℃;为钙依赖性,凝血活性可被EDTA和DTT抑制;FⅤe-1的N端序列为NH2-N-L-Y-Q-F-G-E-M-I-N;具有呈剂量依赖性的促血浆凝固作用?【结论】 从蝰蛇(缅甸亚种)毒纯化出一种FⅤe-1是一个凝血因子Ⅹ的激活物,可激活凝血因子Ⅹ,但对凝血酶和纤维蛋白原的作用微弱?

【关键词】  蛇毒;蝰蛇;凝血因子Ⅹ激活物

　　Abstract: 【 Objective】 To purify and characterize a novel factor Ⅹ activator, FⅤe-1 from Daboia russelli siamensis (Myanmar) venom. 【Methods】 FⅤe-1 was purified by ion-exchange chromatography and gel filtration. The hemostatic activity of FⅤe-1 was determined based on chromogenic substrates. The fibrinogen-clotting activity of FⅤe-1 was also determined. Thermal stability, pH stability, enzyme activity, and inhibition of FⅤe-1 were determined by its remaining procoagulant activity. N-treminal sequence was determined by the method of automated Edman degradation.【Results】 FⅤe-1 was achieved by chromatography with a molecular weight of 13,808 and an isoelectric point of 4.6. The hemostatic activity of 0.5 mg FⅤe-1 was equal to that of 1.5625 u thrombin or that of 54.93 ng RVVⅩ. FⅤe-1 primarily activated FⅩ, but did not affect on prothrombin and fibrinogen. The suitable pH and temperature range of FⅤe-1 was 6.5-7.5 and 25-60 ℃, respectively. The activity of FⅤe-1 was enhanced by Ca2+ and inhibited by EDTA and DTT. The N-terminal sequence of FⅤe-1 was NH2-N-L-Y-Q-F-G-E-M-I-N. 【Conclusion】 FⅤe-1 is a factor X-activating enzyme, which could activate FⅩ to FⅩa, but have minimal effect on prothrombin and fibrinogen.

　　Key words: factor Ⅹ activator; snake venom; Daboia russelli siamensis

　　婴幼儿先天性心脏病体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)术后肺损伤是临床上常见的并发症[1]?其发生的原因与CPB诱导的大量炎症介质释放,CPB期间机械通气停止后肺塌陷后再复张等因素有关?相关研究证实以氟碳化合物(perflurocarbon: PFC) 为媒介的部分液体通气(partial liquid ventil-ation, PLV)可显著减轻CPB以及机械通气所致肺损伤的炎性变化,并显著改善肺通气?换气功能, 显示出良好的实验效果?但多数的研究在CPB结束后以及肺损伤发生后才介入PLV模式[2]?本研究将PFC乳剂OxygentTM在CPB期间经气道灌入肺内,使CPB期间未通气的肺内保持液-液界面开放,观察其对CPB后肺损伤的预防性保护效果并探讨不同剂量OxygentTM的肺保护作用?

　　1 材料与方法

　　1.1 动物和麻醉方法

　　健康幼猪18只,平均体质量(5.1±0.2)kg?动物肌注lu胺酮10 mg/kg后开放耳背静脉,静注静注芬太尼(10 μg/kg),安定(0.5 mg/kg)和派库溴铵(0.1 mg/kg)后,仰卧位插入5F气管插管,行机械辅助通气,初始呼吸参数设置:FiO2 1.0 L/min,呼吸频率30次/min,潮气量10 mL/kg,呼气末正压设定为4 cmH2O,吸气时间0.65 s?经股动脉放置动脉测压管,连接DATEX呼吸气体监测仪监测呼气末CO2?潮气量?气道压和肺顺应性?麻醉维持:持续静脉输注芬太尼(100 μg?kg-1?h-1),间断给予哌库溴铵(0.1 mg/kg)和安定(0.5 mg/kg)?

　　1.2 体外循环(CPB)建立

　　动物取仰卧位,正中开胸,并打开双侧胸腔,肝素化后(400 IU/kg),经升主动脉插入8F主动脉插管,右房插入20F静脉插管,建立传统的非搏动性CPB?循环稳定后在10 min内降温至鼻温26 ℃,建立左房引流,阻断升主动脉并经主动脉根部灌注冷心肌停跳液(灌注量为20 mL/kg),30 min再灌注一次(灌注量为10 mL/kg)?灌注停跳液后调整CPB流量80 mL?kg-1?min-1?CPB期间停止机械通气?心脏停跳60 min后开放升主动脉,并给予0.05 μg?kg-1?min-1肾上腺素维持?开始复温,并逐渐恢复流量,复温至鼻温达到37 ℃循环稳定后撤除CPB?在撤除CPB前恢复原来的机械通气参数?

　　1.3 液体通气实施方案

　　18只乳猪分为3组:Ⅰ组为对照组,CPB期间停止机械通气,持续肺内给予新鲜气体,气体流量为1 L/min,氧浓度为100%,期间维持呼气末正压(PEEP) 4 cmH2O ;Ⅱ组: CPB期间停止机械通气,在CPB期间经气管插管灌入5 mL/kg OxygentTM,予以10 mL/kg潮气量机械通气5 min后停止机械通气,并持续肺内给予新鲜气体,气体流量为1 L/min, 氧浓度为100%,期间维持呼气末正压(PEEP) 4 cmH2O; Ⅲ组:在CPB开始后即刻经气管插管灌入15 mL/kg OxygentTM, 并予以10 mL/kg潮气量机械通气5 min后停止机械通气,并持续肺内给予新鲜气体,气体流量为1 L/min, 氧浓度为100%,期间维持呼气末正压(PEEP) 4 cmH2O?在撤除CPB前用纤维支气管镜尽量吸出肺内的OxygentTM?

　　1.4 指标采集

　　在以下各个时间点: CPB前(t0),CPB结束后5 min(t1)?30 min(t2)?60 min(t3)?90 min(t4)以及120 min(t5)抽取0.2 mL动脉血进行血气分析,并记录各时间点的气道峰值压(PIP)及肺静态顺应性(Compliance),并运用以下公式计算氧合指数[3](oxygenation index, OI=■/FiO2)和肺泡动脉氧分压差[4-5](alveolo-arterial oxygen partial pressure difference,■=■-■,■= ■-×1.25)?

　　1.5 组织标本处理

　　CPB结束120 min后切除右下肺叶进行病理检查?光镜:肺组织放入40 g/L多聚甲醛溶液固定后,经石蜡包埋,切片,采用苏木素伊红(染色),镜下观察组织病理学改变?电镜:新鲜组织立即于25 mL/L戊二醛溶液预固定保存,经漂洗?脱水包埋后切片染色,于H-600透射电子显微镜下观察肺泡II型细胞的改变?