中药预处理对动物模型HIRI的防护作用

肝脏的缺血再灌注损伤(Ischemia Reperfusion Injury，IRI）是导致肝叶切除、肝移植术后器官功能障碍和衰竭的重要因素［1］，为肝脏外科尚未完全解决的棘手问题。因此，如何在有效控制入肝血流、减少术中出血的同时，提高肝脏对缺血的耐受性，减轻肝脏的缺血再灌注损伤，是肝脏外科研究的中心内容。目前，针对肝脏缺血再灌注损伤（Hepatic Ischemia Reperfusion Injury， HIRI）这一问题，可采取缺血预处理、间歇血流阻断和药物预处理等措施加以防护，其中药物预处理是利用某些活性物质直接或间接的药理作用来达到类似缺血预处理的保护作用［2］。现就中药预处理对动物模型HIRI的防护作用研究作一综述。

    1  缺血再灌注损伤的发生机制［3］

    IRI是一个多因素参与的病理生理过程，发病机制主要与以下因素相关。

    1. 1  代谢性酸中毒

    肝缺血后， 肝脏细胞供氧不足，无氧糖酵解增加，导致代谢性酸中毒。再灌注后，代谢性酸中毒被迅速纠正，增强了pH依赖性酶类，如磷脂酶、蛋白水解酶等的活性，促进了细胞的死亡，这种现象称为pH反常。

    1. 2  氧自由基的产生

    再灌注时主要通过黄嘌呤氧化酶系统、吞噬细胞系统和线粒体呼吸链系统三条途径激发氧自由基。氧自由基一方面可直接损伤肝细胞膜，导致细胞的破坏;同时又可损伤内皮细胞，引起微循环完整性的丧失和血流的减少，是缺血再灌注损伤的主要原因。

    1. 3  钙超载

    钙超载引起肝损伤的机理是：细胞内高浓度Ca2+可促使黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶转化，从而为氧自由基的产生提供了催化剂；枯否细胞(Kupffer cell， KC)的钙超载是其被激活的根本原因，激活的KC可通过释放大量毒性介质参与或介导肝脏损伤。此外内皮细胞的钙超载可导致肝内微循环阻抗增大，使再灌注微循环血流量降低。

    1. 4  无流现象

    缺血再灌注可引起肝窦内皮细胞的凋亡、坏死， 从而导致许多肝脏微循环区域血流的完全停止。

    2  中药在HIRI防治方面的优势

    随着近年来生物化学、分子生物学的发展，肝脏缺血再灌注的生化过程及分子机制逐渐明确，众多学者针对缺血再灌注损伤的发病机制，提出诸多防止和减轻HIRI的方法和措施，譬如缩短热缺血时间、缺血预处理、药物预处理，在此只说药物预处理。对HIRI具有预处理效果的药物主要有钙通道阻滞剂、自由基清除剂、抗细胞凋亡剂以及具有改善微循环或细胞能量代谢等药物［4］。然而，其中许多药物具有较大的毒副作用，因此，诸多中药制剂成为热点，其优势可用“广、小、多”三个字概括即安全范围广、毒副作用小、作用靶点多。丹参能防止HIRI时肝细胞内钙超载，具有减轻氧自由基(oxygen free radicals，OFR)和脂质过氧化损伤；阻断FAS和穿孔素的交叉作用途径；稳定细胞膜、细胞器膜的完整性等功能，这些功能能明显减轻对再灌注后肝细胞的损害，充分体现其多靶点的优势。

    3  相关中药对HIRI的防护作用

    3.1  活血化瘀药

    3.1.1  丹参及复方丹参

    现代医学研究表明，丹参具有改善微循环、抗OFR等作用。卢绮平等［5］研究发现， 3种不同浓度的丹参均有阻止跨膜内流作用，且在低浓度组即可体现， 并较“异博停”作用显著。因此认为丹参可能是作为一种选择性作用“受体操纵性Ca2+通道”药物在HIRI中发挥重要作用。可见，丹参作为钙通道调节剂和OFR清除剂对HIRI能起到保护作用。

    王茂林等［6］通过大鼠模型观察肝组织中丙二醛（malondialdehyde ，MDA）含量和血清中丙氨酸转氨基转移酶（alanine amiotransferase，ALT，旧称谷-丙转氨酶即GPT）的变化以及两者变化的相关关系。结果显示， 肝缺血再灌注时肝组织中MDA的含量及血清中ALT含量均显著增高，且两者成正相关，丹参能显著降低肝组织MDA的含量及血清中的ALT、总胆红素(total bilirubin， TB)含量，表明OFR参与了HIRI。

    张文海等［7］研究了复方丹参对大鼠肝细胞线粒体再灌注损伤的影响，结果显示应用复方丹参使复流后2～6h肝细胞和复流6h肝细胞线粒体的MDA的浓度显著降低。通过分析可知，丹参作为复方丹参的主要成分，其能作为自由基清除剂增加内源性超氧化物歧化酶（Super Oxide Dismutase，SOD）的活性，可有效抑制肝细胞的脂质过氧化反应，阻滞血钙的胞内转移［8］，且能有效改善肝脏的微循环。该实验结果还提示复方丹参通过抑制脂质过氧化反应保护线粒体的结构和功能，维持肝细胞的能量代谢，从而在一定程度上减轻肝脏的再灌注损伤。

    3.1.2  川芎嗪和阿魏酸钠

    川芎嗪是中药川芎中分离提纯的一种生物碱单体四甲基吡嗪。文献 ［9，10］采用大鼠模型， 观察发现川芎嗪可显著减少血清转氨酶（AST和ALT）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase ，LDH）的溢出，减轻HIRI后肝细胞病理性损伤；明显降低肝组织脂质过氧化物、血栓素B2（TXB2），维持缺血及再灌注期SOD活性，提示TXB2、PGI2（前列环素）使微循环调节因子的代谢失衡是参与HIRI发生的重要因素之一， 川芎嗪可对抗TXB2的合成与活性， 从而减轻对肝脏的IRI。林丽娜等［11］用家兔HIRI模型， 同样观察到川芎嗪对HIRI时LDH活性的异常改变有明显的保护作用。

    王万铁等［12］利用家兔急性肝缺血模型观察了3组家兔存活率和肝血流在阻断前及开放后各时相点的血清GPT、GOT［门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase， AST）的旧称］和MDA的水平变化，结果显示，川芎组家兔存活率显著高于对照组和盐水组，后两组无显著差异，而血GPT、GOT在阻断及再开放后虽显著增高，但均明显低于对照组，川芎组MDA水平明显低于对照组，且肝细胞诸多病理损害程度较对照组均明显减轻。这些结果有力证明了川芎嗪有保护肝细胞功能的作用。早有研究表明，川芎嗪不仅是OFR清除剂，而且也是一种见效快、疗效好的钙通道阻滞剂。由此我们可以初步认识到，川芎嗪对急性缺血性肝损害的治疗作用机制可能是，通过抑制脂质过氧化物的形成和Ca2+大量内流而打破OFR介导的细胞损害之恶性循环，从而保护了细胞膜结构和功能的完整性，延缓急性缺血性肝损伤的发生。

    另一实验证实，川芎嗪能提高机体内源性SOD活性，同时可清除OFR，进而降低组织脂质过氧化程度，并且在肝脏缺血再灌注一定时间后加用川芎嗪后，能使本已降低的三磷酸腺苷(ATP)、总腺苷量（TAN）和肝脏的细胞能荷（EC）均明显高于模型组，肝细胞形态学异常也明显减轻，表明川芎嗪可通过增加肝细胞能量而减轻HIRI。

    王万铁等［13，14］采用家兔HIRI模型进行研究， 结果观察到随着肝缺血再灌注时间的延长， 肝组织浸润程度逐渐加重， 肝细胞形态学异常变化显著， 川芎嗪在明显减轻上述异常变化的同时，可明显减轻HIRI时血小板最大聚集率、聚集坡斜率、最大聚集时间的异常变化。提示川芎嗪可通过抑制血小板聚集、粘附、活化而减轻HIRI。

    阿魏酸钠（Sodium ferulate，SF）是阿魏酸的钠盐，是桂皮酸的衍生物之一，中药川芎、当归、升麻等多种中药都含有阿魏酸。具有抗炎、抑制血小板凝集、抑制血栓合成酶活性和抗自由基等作用［15］ 。贺德等［16］发现SF对HIRI有明显保护作用，而这种作用主要是通过对抗OFR来实现的，同时发现SF保护组再灌注2 h后，其肝脏的结构和生化指标均不能达到肝缺血前水平。贺德［17］研究结果显示阿魏酸钠清除OFR的作用逊色于SOD， 但两者对大鼠肝缺血再灌注所致肝细胞的结构和功能损伤的保护作用基本相同。

    3.1.3  三七总皂甙

    三七总皂甙（Panax notoginseng saponins，PNS）是从中药三七中提取的活性有效成分，具有抑制血小板聚集和增加脑血流量的作用。彭宝岗等［18］的研究结果表明三七总皂甙阻断效果优于维拉帕米和垂体后叶素， 且呈剂量依赖性。另采用Asadawa法在大鼠左中肝缺血模型上行体内实验， 结果也证明三七总皂甙对HIRI的减轻效果明显优于维拉帕米。梁力健等［19］发现三七总皂甙可提高HIRI模型生存率， 其在降低ALT水平、减轻肝细胞坏死以及提高SOD活性方面均优于维拉帕米。

    Caspase-3是caspase家族蛋白酶的重要成员之一。现在一般认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）其杀伤机制的重要组成部分。李远明等［20］利用大鼠原位肝移植模型研究证实，在供肝再灌注后6 h时肝细胞凋亡最明显，该时点的凋亡指数明显高于其他时点。结果显示，供肝再灌注后早期（2 h）caspase-3和肝组织肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达高于后期（24 h）；供肝再灌注后6 h转氨酶最高。这说明肝细胞凋亡在移植后再灌注早期即可发生，并可能参与肝移植后缺血再灌注早期损伤过程，caspase-3和TNF-α是促进细胞凋亡基因，移植肝组织中两者的表达与肝细胞凋亡正相关关系。此实验在切取供肝前用PNS预处理，通过其拮抗钙离子、减少自由基的产生、保护线粒体等途径达到阻遏或延迟细胞凋亡的作用。

    3.1.4  灯盏花素（Breviscapine）

    灯盏花素是从菊科短亭飞蓬灯盏花中提取分离的黄酮类有效成分，具有活血化瘀、消炎止痛等功效。许多研究表明，灯盏花素对重要器官的缺血再灌注损伤有保护作用［21］。灯盏花素可通过调节Ca2+内流抑制Ca2+超载，减少自由基［22］，阻止细胞凋亡，减轻脑缺血再灌注所致的神经损伤。史小琴等［23］通过在HIRI模型上应用灯盏花素的实验表明，灯盏花素能通过抑制OFR的生成，减少OFR， 并提高肝缺血再灌后SOD 活性，对HIRI起良好的抗脂质过氧化作用。同样是史小琴等［24］研究表明，使用灯盏花素保护家兔HIRI后，SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase， GSH-Px)活性显著升高，MDA水平下降，肝细胞病变程度明显减轻，且减轻程度具有一定的剂量依赖关系。

    3.1.5  银杏叶及银杏提取物   

    银杏叶主要成分为银杏黄酮，具有敛肺平喘，活血止痛功效，现主要应用于肺虚咳喘，以及许多心脑血管疾病。银杏提取物（ginkgo biloba extract， EGb）的主要有效成分为黄酮类和内酯类化合物，具有广泛的药理作用，大量研究已证实EGb具有多价的药理作用。 威玛舒培博士在数以千次银杏叶提炼过程中发现第761次试验提取物所含EGb纯度最高、药效最佳，命名为EGb761。［25 ］班润武等［26］采用肝热缺血再灌注动物模型的实验证实，缺血再灌注3 h时凋亡最明显，与不同时间组间肝、肾、肺、小肠凋亡指数相比有显著性差异，而且以上四器官的形态、功能改变与细胞凋亡情况具有一致性。说明细胞凋亡可能是缺血再灌注后多器官损伤的重要机制之一，EGb761可能是通过阻止细胞凋亡途径而发挥对多器官的保护作用。张建华等［27］对豚鼠和SD大鼠非协调性异种肝移植缺血再灌注模型移植前给予金纳多(第4代银杏叶提取制剂)，发现移植后供肝灌注充分、均匀，肝灌注障碍有所改善；超微结构观察显示肝细胞肿胀减轻，窦状隙血小板减少，内皮细胞较完整，表明金纳多对异种肝移植缺血再灌注损伤有保护作用。

    景生虹等［28］通过在大鼠自体原位肝移植模型上应用银杏内酯（Ginkgolide，G），观察G对大鼠移植HIRI的保护作用。结果显示在移植肝PV复流5min、30min、120min时血清中的NO水平显著升高，酶学指标及肝细胞内超微结构变化较模型组有显著改善，说明G对大鼠移植HIRI有显著的保护作用，并推测这种作用可能由NO介导。另外本实验G组在肝移植PV复流2 h后肝组织ATP含量较模型组显著增高，而MDA含量较模型组显著降低，进一步证实了其对线粒体的保护作用和对自由基的清除作用。而这一结论恰好被“G所含的萜内酯A和B能降低线粒体对氧需求的敏感性”［29］所解释，即在缺血缺氧条件下，仍能通过维持线粒体的呼吸功能而发挥保护肝细胞的缺血再灌注损伤作用。