实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中PRL-2基因的表达

    2.2   灵敏度及特异性检测

    为了验证TaqMan 方法的特异性,我们将拷贝数分别为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×10的标准品经PCR 扩增和1.1 系统分析,产物进行3 %琼脂糖电泳(图1) 。电泳图显示,各泳道在130 bp 左右的位置均有特异性条带出现,并且荧光强度随起始模板数的递减有逐步降低的趋势。值得注意的是1×106 ～1×103之间的4个条带差别不明显。上述结果说明单靠普通的半定量PCR是无法准确预测初始拷贝数的。我们将特异性条带切下后,装入pGEM Teasy 载体,以M13 primers 进行测序,结果正确,从而保证了方法的特异性。本研究设定大于40 个循环仍无荧光信号明显增强为阴性标本。当以标准品进行10 倍连续稀释,发现最低可以检测1×102拷贝，最高可检测到5×106拷贝。将正常肝细胞系CL-1总RNA 作为模板,该样本PRL-2 mRNA 表达量均< 102 拷贝,检测结果阴性 ,故该方法的灵敏度约为100 拷贝。

    2.3   方法的重复性

    将5个不同稀释度的标准品(1×102～1×106拷贝)分6批次进行检测,以拷贝数得其批间变异(CV)分别为21.2% ,17.8% ,11.4%，26.5%,46.8% ;我们将上述5个标准品一式3 份检测,以拷贝数计算其批内CV 分别为32.1%，14.2%，10.7%，21.6%,40.3%。上述结果表明该方法的重复性好，特别是在浓度较低的情况下。

    2.4   PRL-2在肝癌、癌栓和癌旁组织中的表达

    Q-PCR技术检测发现12例肝癌患者门脉癌栓和10肝癌组织可检测到PRL-2 mRNA 表达，但是仅有4例癌旁组织可以检测到PRL-2 mRNA 表达。2例肝癌组织内未检测到PRL-2表达的患者，8例癌旁组织内亦未检测到PRL-2表达。其中门脉癌栓表达水平平均高于肝癌组织将近100倍（P< 0.01）; 肝癌组织比癌旁组织表达高出将近10倍（P< 0.01，表1）。PVTT和肝癌组织mRNA表达的相关系数为0.778。        

    3   讨   论

    3.1   RT-PCR技术的原理及其优越性

    多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR) 技术发明至今已近20 年了,在这期间其技术得到了不断的发展, 于1996 年推出的Q-PCR技术实现了PCR 从定性到定量的飞跃。Q-PCR 是一种用于定量测定起始模板拷贝数的新技术, 其原理为:在PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程, 荧光信号的强弱与靶基因的量即扩增产物的量成正比关系[10,11]，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法与常规PCR 相比, 具有特异性更强、有效解决PCR 污染和自动化程度高等特点, 目前已得到广泛应用。

    3.2   RT－PCR 方法定量测定PRL-2表达

    由于mRNA 用Q－PCR 方法进行定量时, 还需考虑到反转录效率以及mRNA 容易降解等问题, 因此我们通过T 载体克隆方案构建含PRL-2 基因的载体, 用所提取质粒DNA 作为实时荧光定量RT－PCR 的标准模板, 具有纯度高、来源广、易于保存、定量准确等优点,可长期用于检测。经过对质粒模板进行不同浓度梯度稀释, 检测扩增过程中荧光信号强弱来制备标准曲线,相关性好, 斜率达-3.52, 显示出随不同模板量而出现CT值良好的变化。在以往的PRL表达的研究中，大部分的工作采用了原位杂交、RT－PCR 和Northern blot 方法[6-8]，但是上述方法只能半定量分析,不能在mRNA 水平定量准确检测表达。而应用Q－PCR 技术可以对mRNA 水平进行实时定量分析。对12 例肝癌的PRL-2 基因的表达水平分析发现,肝癌中PRL-2 的表达水平普遍升高，而且所有PVTT的mRNA 水平是肝癌组织的800倍以上,肝癌组织表达水平是癌旁组织的8倍以上,说明PRL-2 作为在肿瘤发生发展中的重要分子可能发挥了特殊的作用。表达上调不但具有普遍性,而且具有极为明显的差异,提示可以用于癌肿复发或转移的预测和监视。

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