依诺沙星片血药浓度的测定及在健康志愿者体内的药动学研究

【摘要】  目的:建立人血浆中依诺沙星浓度的高效液相色谱（HPLC）方法，研究口服单剂量依诺沙星片后健康志愿者体内的药物代谢动力学过程。方法:健康志愿者20名，单剂量口服依诺沙星片0.4 g，分别于服药后24 h内多点抽取静脉血。以HPLC法测定血浆中依诺沙星的浓度。以DAS药代动力学程序计算药动学参数，分析体内的药动学过程。结果:依诺沙星片在(0.05～6.0)mg·L-1范围内线性关系良好(r=0.9999)，相对回收率均在85%～115%范围内，绝对回收率大于75%；日内和日间变异均小于15%。依诺沙星浓度主要药代动力学参数为：Tmax为(1.350±0.580) h；Cmax为(3.029±0.671) mg·L-1；T1/2为(5.835±0.908)h；AUC(0-24)、AUC(0-inf)分别为(17.678±2.899) mg·h·L-1和（18.685±3.172）mg·h·L-1。结论:本方法灵敏度高，选择性好，重现性佳，可准确测定人血浆中依诺沙星的浓度，适合药动学研究，为临床用药提供指导依据。

【关键词】  依诺沙星 高效液相色谱法 药代动力学

   依诺沙星（Enoxacin），化学名为1-乙基-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-7-（1-哌嗪基）-1，8-萘啶-3-羧酸倍半水合物，为三氟喹诺酮类抗菌药，能通过抑制细菌的DNA回旋酶、拓扑异构酶IV，抑制DNA的合成和复制而导致细菌死亡。其具有广谱抗菌作用，对大多数革兰阳性菌和革兰阴性菌具有良好的抗菌活性，对沙眼衣原体、支原体、军团菌具良好的抗微生物作用，对结核杆菌和非典型分枝杆菌也有抗菌活性[1]。本实验旨在建立简单快捷的检测方法，研究依诺沙星片在中国健康志愿者体内的药代动力学，为临床用药提供参考依据。

    1  材料和方法

    1.1  药品、试剂和仪器  依诺沙星片（规格：0.1 g/片）、氟罗沙星由湖北百科亨迪药业有限公司提供。依诺沙星对照品由中国药品生物制品检定所提供。甲醇和乙腈为色谱纯，由天津市科密欧化学试剂开发中心提供。三氟乙酸为Sigma公司产品（064K3647）。70%高氯酸、冰乙酸为分析纯，由天津市化学试剂三厂生产。实验用水为本实验室自制重蒸水。

    高效液相色谱仪为Agilent1100系列，包括G1322A在线脱气机、G1311A四元泵、G1313A自动进样器、G1316A温控箱、G1315B二极管阵列检测器和Agilent 化学工作站（Rev A.10.02.[1757]）。其他仪器包括：电子分析天平（AB204-A，梅特勒-托利多上海仪器公司产品）、旋涡混合器（XK96-B，姜堰市新康医疗器械有限公司产品）、重蒸水仪（1810-B型，江苏金坛市科析仪器有限公司产品）、台式高速冷冻离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂产品）。

    1.2  受试者选择  根据药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则[2]，选取20名健康男性志愿者，年龄21～24岁，体重55～77 kg。受试者无烟酒嗜好，无神经系统、精神异常及代谢异常等病史，血尿常规、肝肾功能及心电图等检查均正常。受试前2周至整个试验期间禁烟、酒和禁服其他任何药物。试验方案经医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

    1.3  给药方法和样品采集  20名受试者禁食12 h后，于次日清晨空腹口服单剂量依诺沙星片0.4 g，200 ml温开水送服，服药2 h后方可饮水，4 h后进统一餐。服药前取空白血，服药后分别于0.333、0.667、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h取静脉血3.0 ml，注入肝素化的试管，离心（3 000 r·min-1×10 min），取血浆，-65 ℃冰冻保存备测。

    1.4  血浆样品处理及血药浓度测定

    1.4.1  色谱条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6×150 mm，5μm，Agilent，USA）；保护柱：XDB-C18保护柱（4.6×12.5 mm，5μm，Agilent，USA）；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸-水（20：20：60，V/V/V）；流速：1.0 ml·min-1；柱温：40℃；检测波长：342 nm。

    1.4.2  血浆样品的处理方法：准确吸取待测血浆样品0.5 ml于1.5 ml EP管中，加入100 mg·L-1氟罗沙星内标应用液50μl，再加入35%高氯酸40μl，旋涡振荡10 s后，12 000 r·min-1，离心10 min。取上清液300μl于自动进样器的样品瓶中，设定20μl进样检测。

    1.5  血浆标准曲线的制备和定量下限

    1.5.1  血浆标准曲线的制备：取8支1.5 ml EP管，分别加入不同浓度不同体积的依诺沙星标准工作溶液，再用空白血浆补充到体积为0.5 ml，配成浓度相当于0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 mg·L-1的血浆样品，再按1.4.2项处理方法处理后，测定依诺沙星峰面积Ai、内标峰面积As，以Ai/As为纵坐标，以所对应各点浓度（C）为横坐标绘制标准曲线。经最小二乘法线性回归，得依诺沙星的标准曲线回归方程为C=6.2271Ai/As+0.0137（r=0.9999）。

    1.5.2  定量下限：取标准曲线的最小浓度值0.05 mg·L-1为定量下限。

    1.6  方法学考察

    1.6.1  色谱行为：依诺沙星纯标准品、空白血浆、血浆标准品以及健康受试者血浆样品，经HPLC分析测定得到色谱图。
   

1.6.2  精确度：准确配制浓度为0.10、1.00、4.00 mg·L-1的血浆标准溶液（每个浓度5份），再按1.4.2项处理后，于同一日内测定5次和连续5 d测定，计算日内、日间变异率。

    1.6.3  相对回收率：准确配制浓度为0.10、1.00、4.00 mg·L-1的血浆标准溶液（每个浓度5份），再按1.4.2项处理后，进样检测，计算检测量。以检测量与加入量的比值计算回收率。

    1.6.4  绝对回收率：分别配制浓度为0.10、1.00、4.00 mg·L-1的依诺沙星纯标准品溶液，取20μl进HPLC检测，记录各自的峰面积；再配制浓度为0.10、1.00、4.00 mg·L-1的依诺沙星血浆标准品溶液，按1.4.2项的血浆样品处理方法处理后测定，记录各自的峰面积；以血浆标准的峰面积与纯标准品峰面积的比值计算绝对回收率。