依诺沙星片血药浓度的测定及在健康志愿者体内的药动学研究

    1.6.5  样品稳定性

    1.6.5.1  处理后的血浆样品在自动进样器内的稳定性： 本试验所采用的高效液相色谱仪的进样器为全自动进样器，最大样品数为100个，第一个样品与最后一个样品的检测时间有较长的时间间隔，故应观察处理后的血浆样品在进样器的样品瓶内放置的稳定性。配制低、中、高三个浓度的依诺沙星血浆标准溶液，按1.4.2方法处理后，分别检测在进样器内放置0、6、12 h的浓度，观察其稳定性。

    1.6.5.2  冻融条件下血浆样品的稳定性：配制低、中、高三个浓度的依诺沙星血浆标准溶液，每个浓度2 ml, 放置-65 ℃冰箱2 h后解冻，各取0.5 ml血浆样品检测。剩余的血浆样品再次放入-65 ℃冰箱中，2 h后解冻，各取0.5 ml血浆样品检测。重复2次，考察其稳定性。

    1.6.5.3  室温放置和冰冻保存血浆样品的稳定性：配制低、中、高三个浓度的依诺沙星血浆标准溶液，每个浓度4 ml，每个浓度5份，其中3份在室温下放置0、6、12 h后再经血浆样品处理方法处理后进样检测，记录结果。另外2份分别在-65 ℃冰箱冰冻保存2周和4周后，再经血浆样品处理方法处理后进样检测，记录结果。

    1.7  统计学处理方法  用DAS（Drug And Statistics，version2.0）程序处理，非房室模型计算药动学参数。Cmax和Tmax均为实测值；AUC为DAS计算所得。

    2  结果

    2.1  方法学  依诺沙星的色谱行为见图1。显示其保留时间为2.9 min，内标氟罗沙星的保留时间为3.5 min。两峰分离完全。精确度、回收率、稳定性实验结果如表1～4。依诺沙星血浆样品的日内日间精密度标准偏差均在10%以内，相对回收率标准偏差在5%以内，绝对回收率在75%以上。在室温放置12 h以内测定，结果没有明显变化；-65 ℃冰箱冰冻条件下冷藏1个月内测定，结果同样无明显变化。以上说明血浆样品具有较好的精密度和准确性，在室温放置和冰冻保存条件下表现出良好的稳定性。

    2.2  药代动力学  20名健康志愿者单剂量口服0.4 g依诺沙星片后，用HPLC法测得不同时间的依诺沙星平均血浆药物浓度-时间曲线，见图2。20名健康志愿者单剂量口服依诺沙星片的主要药代动力学参数见表5。

    3  讨论

    伊诺沙星血药浓度的HPLC检测法，文献[3-5]报道多以柠檬酸-甲醇-乙腈作流动相为主。本研究曾参照该条件进行分析，但未取得良好的分离效果。由于伊诺沙星分子结构中的胺基和羧基能在水溶液中解离，故考虑单独以乙腈-水或甲醇-水为流动相，会出现色谱峰拖尾、对称性差、分离度低和保留值不稳定等问题，而采用离子抑制或离子对色谱能克服这些缺点[6]。三氟乙酸是离子对试剂常见的手段。流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。此外，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200 nm，检测干扰小。其添加在流动相中的浓度一般为0.1%，在该浓度下，大部分反相色谱柱都可以产生良好的峰形，故本研究以乙腈-0.1%三氟乙酸-水（20：20：60，V/V/V）为流动相，并取得了良好的分离效果。如图1所示，可见出峰对称，无杂质干扰，专属性高。且分析时间仅为4 min，适合临床血药浓度的分析监测，有利于个体化用药的开展。

    依诺沙星在整个紫外区均有吸收，210 nm、270 nm和342 nm处有吸收峰，由于270 nm为最大吸收，故文献[3-7]报道多以270 nm左右作为检测波长，但本研究考虑到342 nm处血浆内源性物质少，为避免干扰，采用342 nm作检测波长，得到干净利落的检测峰形。

    对血浆样品的处理我们采用35%高氯酸蛋白沉淀法，较萃取法[4，5]操作简便，成本低廉，且专属性高，分离完全，有较高的回收率和精密度，适用于依诺沙星人体药代动力学和血药浓度分析。

    本研究所得血药浓度数据及主要药物动力学参数与文献报道[4，5]基本一致。其达峰时间较短，Tmax为（1.350±0.580） h， T1/2为（5.835±0.908） h， AUC(0-24)、 AUC(0-inf)分别为（17.678±2.899） mg·h·L-1和（18.685±3.172）  mg·h·L-1，提示依诺沙星口服吸收迅速且完全。本实验研究数据为临床用药提供了指导依据。

    整个研究期间，20例健康志愿者中无一例因不良反应而终止试验，其血液、血液生化、尿常规以及心电图检查在试验前后均未见异常，说明本品在试验剂量下表现出良好的安全性。

【参考文献】
  [1] 王永利, 郭芳. 人工合成抗菌药[M]/杨世杰.药理学. 北京:人民卫生出版社,2005:450.

[2] 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则[M]/中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国药典.二部. 北京: 化学工业出版社,2005:173-176.

[3] 李彬,王海意,吴鸿范. 高效液相色谱法测定血清中依诺沙星浓度[J]. 天津医科大学学报, 1995,1(1):30-32.

[4] 夏春华, 戴群, 徐文炜,等. 依诺沙星胶囊人体生物等效性[J]. 中国临床药学杂志, 2001,10(6): 379-381.

[5] 林爱华, 刘奕明, 杨晓燕,等. 依诺沙星胶囊在健康人体的相对生物利用度与生物等效性[J]. 中国临床药理学杂志, 2005,21(2):140-143.

[6] 王珊, 涂岱云, 沈佳特. 高效液相色谱法测定依诺沙星制剂中依诺沙星的含量[J]. 医药导报, 2005, 24(10):949-950.

[7] 谭志荣, 欧阳冬生, 韩仰,等. 依诺沙星分散片的人体相对生物利用度研究[J].中国新药杂志, 2007,16(5): 403-405.